生物工程中残存DNA检验标准的变化
2015年3月底，我国食品药物测验研究院网站的国家药物标准化学物质产品目录中新减少了一个序号为410001的产品：CHO寄主细胞核DNA残存检验烟鼠（PCR-萤光电极法）。这个由该所与我国科学院联手研制，由生物医药民营企业参与校正的烟鼠与现行英国中药（USP）建议的检验方式同步，但与2010版中药第三章中氨甲蝶呤
DNA 残存量NMR有所不同，可能会对亚洲地区生物工程的研制和制造的上中下游民营企业产生影响。
生物工程中寄主细胞核残存DNA具有潜在致瘤和感染风险，所以各国药物监管机构对DNA沉淀物的限量版明确要求十分严苛。英国中药在General
Chapter <1130>介绍了三种常用掌控技术，但将在2015年施行的旧版（USP38–NF33）中减少全新段落（General
Chapter
<30>）来进一步规范残存DNA检验的方式和标准化学物质。与1000号以上的段落不同的是，USP序号1000以内的段落详细规定了检验掌控技术、系统适应能力标准和标准化学物质。旧版USP上将唯一推荐qPCR法作为生物工程中寄主残存DNA的标准方式。qPCR法的掌控技术优势在于序列专一性高、精确度高、重现性好、人为干扰因素少，能为生物医药工业在工艺技术研究和半成品产品质量掌控方面提供更多可靠的检验手段。
我省参照WHO、FDA和欧盟的标准，很久以前开始就对生物工程中残存DNA浓度进行限制。从卫生部施行的《他用重组DNA制品产品质量掌控要点》到近年的《我国生物工程规章》都对DNA浓度做了严苛明确要求，部分标准高于国际标准。2010年版我国中药第三章收录于了DAN电极杂交法和萤光染料法，这三种方式都存有掌控技术缺陷，极难达至沉淀物限量版检验的精确度，已经被欧美中药摈弃。目前，仍有很多亚洲地区民营企业沿用这三种方式检验残存DNA，致使工艺技术技术和食品产品质量极难达至国际一流水平。根据残存DNA检验掌控技术的行业发展趋势，小贴士预计我省2015版中药或重编版本上将出现qPCR方式。民营企业在制造与研制中采用该所标准化学物质产品目录中提供更多的烟鼠，能大幅度减少耗时、费力、成本昂贵的方式学考察，只需开展少量方式适应能力实验，就能在工艺技术技术和产品质量掌控体系的优化方面发挥实际作用，同时满足英国FDA相关标准的明确要求。同时，烟鼠联手研制单位我国科学院衢州营养中心提供更多免费掌控咨询服务和培训，帮助民营企业解决应用中的各种掌控技术问题。
生物工程可用于治疗和预防疾病，关系到患者和糖尿病人的用药安全可靠，食品产品质量必须得到保证。我省药物监管机构对生物工程中残存DNA的限量版标准制订的十分严苛，但中药修订存有一定局限性，第三章中的检验掌控技术与先进国家尚存有差距，民营企业在研制和制造别列济夫具有一定创新性，否则会使改进工艺技术、提高产品质量、保证安全可靠的努力打折扣。
为什么要检验残存DNA？
免疫血清是制药行业中发展最快的领域，2014年全球十大畅销药中7个是免疫血清。这些销售上的重磅炸弹在临床上疗效确切，但研制成本高，制造和产品质量掌控明确要求十分严苛。绝大部分免疫血清是不经过胃肠道直接进入体内，所以除了生物活性外，监管机构对药物中沉淀物的限量版明确要求十分严苛。其中，寄主细胞核残存DNA因为具有特别的潜在安全可靠风险，一直是亚洲地区外药物监管机构关注的重点。英国中药会从2011年开始就组织专门小组讨论修订生物工程中残存DNA检验方式，并在2014年Prescription/Non-Prescription
Stakeholder Forum Meeting5上宣布将在2015年中药修订版中减少新的段落（General Chapter
<30>）来规范检验方式和标准化学物质。为什么英国中药会的专家组花几年时间讨论一个微量成分（<100pg/剂量）的检验方式？还要专门减少段落来规范化？回答这些问题，先要了解它的来源和潜在危害性。生物工程中的重组蛋白药、抗体药、疫苗等产品是用连续传代的动物细胞核株表达制造，虽然经过严苛的纯化工艺技术，但产品中仍有可能残存寄主细胞核的DNA片段。这些残存DNA的片段大小和组成不定，而且潜在的风险也不定，可能带来感染性，或致瘤性，或免疫源性减少，或致突变等风险。比如残存DNA可能携带HIV病毒或Ras癌基因；分布在哺乳动物细胞核基因组的LINE-1序列可能发挥逆转录转座子作用插入到染色体中，这种插入可能影响关键基因功能的发挥，比如激活癌基因或抑制抑癌基因；此外，由于微生物来源的基因组DNA富含CpG和非甲基化序列，减少了重组蛋白药物在体内的免疫源性风险。目前的研究结果显示，残存DNA的致瘤性相比感染性风险要低，但考虑到致瘤性实验是动物实验，感染性实验是在细胞核水平做的，或许对两方面的风险都不能掉以轻心。众所周知，外源蛋白可能引起严重免疫反应，但关于残存DNA诱导的免疫反应的研究还不多。在一些临床前和临床研究中报道了高剂量的多肽样品，比如DNA疫苗或佐剂中的CpG寡聚核苷酸，能诱导免疫反应，还诱导产生DNA抗体。
生物工程中寄主残存DNA既是制造中带来的沉淀物，还存有一定安全可靠隐患。因此，WHO和各国药物注册监管机构一般只允许免疫血清中存有100pg/剂量以下的残存DNA，且鼓励尽量降低残存DNA的量和片段长度（小于一个功能基因的长度，按照目前的证据，大约为200bp）。根据沉淀物来源和工艺技术，特殊情况下最高允许10ng/剂量。
各种残存多肽检验掌控技术的优劣
正如前面讲过，2015年版的英国中药将新增段落对残存DNA检验进行规范化，那究竟和现有方式有什么不同？为什么最后只确定了一种方式？我们来看看现行英国中药对于残存DNA检验的总体明确要求[General
Chapter〈1130〉 NUCLEIC ACID-BASED TECHNIQUES—APPROACHES FOR DETECTING
TRACE NUCLEIC ACIDS (RESIDUAL DNA TESTING)]。因为残存DNA涉及到潜在来源（感染性病毒DNA）、管理规章等关键问题，药物监管机构建议必须建立产品的DNA残存检验方式。不论是否半成品的常规检验包含DNA残存浓度检验，还是工艺技术开发中已经证实了DNA清除率，残存DNA掌控技术指标和定量分析监测规章都必须确立。分析方式包括杂交法、基于DNA结合蛋白的免疫色谱法（阀值法）、定量PCR（Q-PCR）或其他DNA扩增方式。理想的定量检验方式的精确度应该能够检验到约10pg/剂量的残存DNA。杂交法、阀值法和定量PCR方式因为精确度能达至检验明确要求，所以属于经典方式。下面我们引用英国中药（USP）<1130>的内容分别介绍一下这三种方式。
杂交法（Hybridization-based）：在这种方式中，根据寄主DNA序列设计DNA电极用于测定产品中配对DNA的数量。双链DNA被变性成单链后固定在尼龙膜或硝化纤维膜上，DNA电极被随机掺入标记以后，与膜上固定的样品寄主DNA杂交结合，并在胶片或成像仪对应位置中显现斑点。对于萤光标记的电极，斑点的光密度结果能在仪器中定量分析。斑点光密度对应结合在目标DNA上的电极数，进而推测出残存DNA的数量。通过目测方式能半定量地检验样品中残存DNA，仪器读片能对应斑点光密度绘制标准曲线，对应检验结果更加准确。
DNA结合蛋白免疫阈值法（DNA-BINDING PROTEIN-BASED）：这种方式使用DNA结合蛋白和DNA抗体，分四步检验。第一步，通过加热把DNA变性成单链DNA，变性后DNA与偶联了亲和素的DNA结合蛋白以及偶联了尿素酶的DNA单克隆抗体混合反应，液相中的单链DNA、DNA结合蛋白、DNA抗体共同形成序列非特异的复合物。第二步，样品混合液通过生物素标记的膜，亲和素-生物素结合把DNA复合物固定在膜上，洗去非特异吸附。第三步，膜放入检验仪器中与尿素溶液反应，反应产物氨改变溶液pH值并被仪器记录变化。这种pH值的变化直接与样品中的DNA数目相关。第四步，仪器软件自动分析原始数据确定样品中残存DNA数量。
定量PCR法（QUANTITATION PCR-BASED）：qPCR方式以其快速、高通量的特点已经被应用于生物医药的一些领域（拷贝数检验与病毒检验）。这项掌控技术能够确定各种样品中目标DNA序列的准确数量。DNA电极的设计十分关键，这种DNA电极包含一端染料分子和另一端淬灭分子。当特殊设计的DNA引物引导DNA聚合酶沿着模板序列复制合成另一条对应序列时，DNA聚合酶切断结合在目标DNA上的电极染料端，释放到反应液里的染料信号被仪器测量。经过数十个循环的DNA扩增，萤光信号与起始DNA模板成对应关系，对应标准曲线能准确计算出样品中残存DNA的数量。
英国中药第三章进一步对三种方式进行了应用评价。杂交法能序列专一性地检验目标DNA，但32P标记的电极因为存有半衰期短、放射等问题，实际应用并不广泛。萤光标记的电极如果采用仪器读取信号，杂交法理论上能达至定量检验明确要求的精确度，但是检验时间需要48小时。阈值法因为是采用DNA抗体的非特异序列免疫检验掌控技术，不能专一性识别寄主残存DNA序列，且容易受到环境和操作人员的DNA污染，导致读值偏高。qPCR法具有序列专一性，精确度、准确度、精密度都好，还能高通量筛选，但开发一个合格的q-PCR试剂检验寄主残存DNA并不是件容易的事情。有人会提出疑问，终产品别列济夫该限定任何物种的DNA残存以确保安全可靠性，所以阈值法是不是最合理的分析方式？这里还需要强调一下寄主残存DNA检验的目的：1.确认纯化工艺技术合理，能有效去除寄主DNA残存；2.确认产品中沉淀物浓度符合标准明确要求。非专一性的DNA检验结果不能区分究竟是制造中污染、检验污染、或是工艺技术缺陷引起的DNA残存，就无法为解决方案提供更多有效信息。在严苛的制造体系中，残存DNA检验是解决工艺技术合理性问题，任何外源污染问题都归SOP或GMP管理体系解决。最后，经典的残存DNA检验方式精确度不同，qPCR法、DNA结合法、杂交法的检验限分别达至<1、3、6pg/样品的水平（目前qPCR法精确度可达10fg/反应），但是掌控技术上限制，明确要求待测DNA片段分别不能小于50、150、600bp才能用于杂交法、q-PCR法、阈值法检验，而WHO和FDA可接受的DNA
限度内的片段长度<200bp。由此可见，这三种方式中，qPCR法的适用性和掌控技术指标最好。从qPCR掌控技术原理来看，Taqman法要优于萤光染料随机掺入的SYBR
Green法。正如前面介绍的USP修订内容，经过几年来对三种检验方式的系统研究和应用反馈，英国中药会将在旧版中药中唯一推荐qPCR法作为生物工程残存DNA检验的标准方式。
我省生物工程中残存DNA检验标准与掌控技术
我省参照WHO、FDA和欧盟的标准，很久以前开始就对生物工程中残存DNA的浓度进行限制。酵母、大肠杆菌表达的生物工程限定不超过10ng/剂，CHO和vero细胞核表达的EPO、狂犬疫苗、乙肝疫苗等不超过100或10pg/剂。2010年版我国中药第三章收录于了DNA
电极杂交法和萤光染料法作为残存DNA检验方式。以地高辛标记斑点杂交法为代表的DNA杂交法因为操作复杂，耗时较长，且只能半定量，在2014年英国中药修订版征询意见稿中（
PF40(2)）中已经被剔除。以PicoGreen为代表的萤光染料法是基于萤光染料分子直接与双链DNA结合后,经带有萤光检验功能的酶标仪激发后产生萤光信号，因为不能检出单链DNA，且没有序列专一性，以及精确度较低（>300pg）等原因，早已被欧美中药摈弃。
我省2010版中药及2015版中药（第三章IX B 氨甲蝶呤 DNA
残存量NMR）的征求意见稿中收载了的DNA电极杂交法和萤光染料法，而2009年英国USP就收录于了杂交法、阈值法和qPCR法，到2015年底USP将只收录于红外、高专一性的qPCR法作为残存DNA检验的推荐方式。由此可见qPCR法将成为国际公认的残存DNA检验方式，也可能会是我省下一版中药的主要修订内容。亚洲地区生物工程研制与制造民营企业，以及制造纯化填料的上中下游民营企业，尽早建立以qPCR方式为基础的寄主残存DNA检验体系，将有利于改进工艺技术、提高食品产品质量，实现与欧美发达国家生物药物标准的接轨。
国家标准化学物质库中的烟鼠掌控技术性能
为了提升亚洲地区民营企业和监管机构对生物工程中寄主残存DNA的检验掌控技术水平，实现与国际标准的接轨，该所联手我国科学院、制造与研制民营企业开发了首个基于qPCR掌控技术，具有自主知识产权的国产CHO寄主细胞核DNA残存检验烟鼠。研制中除了常规方式学研究和稳定性考察，还开展了DNA碎片化、种属专一性、不同仪器的通用性、高蛋白、低pH、高盐、国外同类产品性能对比等研究，并在验证试验中考察了对亚洲地区多家制造民营企业和研制民营企业不同样本基质的适用性。由该所采用国家标准化学物质CHO细胞核DNA校正并验证的烟鼠提供更多了从样品提取、纯化到PCR检验的整套试剂，检验限达至10fg/rxn，抗人、大鼠、小鼠等基因组干扰，内标加样回收率在70~130%（旧版英国USP的标准将调整为50~150%），能为CHO细胞核表达的不同品种、不同剂量的免疫血清提供更多灵活、准确的DNA限量版检验。烟鼠具有2年保质期，并由联手研制单位我国科学院衢州营养中心提供更多免费掌控咨询服务、操作培训和方式学验证服务，帮助民营企业尽快掌握该掌控技术。该所和我国科学院衢州营养中心的联手研制项目还将陆续推出E.coli、Yeast和vero细胞核残存DNA检验烟鼠，为亚洲地区生物医药产业的发展、为监管机构制订国家标准提供更多掌控技术支持。
