5混1、10混1、20混1…PCR混样检测的极限在哪里？

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先梳理一下新冠病原体多肽混样检测的历程：

一、5合1混样

2020年7月21日中华人民共和国国务院应付新式冠状病原体肺结核禽流感共管共管监督机制医疗保健抢救组正式发布了《新冠病原体多肽筛检溶化混样检测控制技术提示》一、适用于对象新式冠状病原体多肽筛检溶化混样控制技术（下列简称溶化混样）仅适用于于大群体样品的筛检，溶化混样检测结果不作为最终诊断依据。在群体总体误诊率较高（低于0.1%）时更为适宜。下列群体不建议采用溶化混样检测：

（一）重点项目区域群体（上周有禽流感发生的住宅小区含诊断病例和无症状感染者、老旧住宅小区、人口密集住宅小区、农村居民聚集地和上周离省外出群体）、其他不适合溶化混样检测的群体；

（二）公立医院就诊患者。

二、微生物药理学前提1.根据《病原微微生物微生物药理学微生物安全可靠管理条例》（中华人民共和国国务院424号令），具有在县级的市级人民政府环境卫生身心健康主管部门登记的微生物安全可靠二级及以上微生物药理学。2.根据《公立医院医学DNA扩充检测微生物药理学管理办法》（卫办医牛驼〔2010〕194号），具有经过省级环境卫生身心健康行政部门审核登记的医学DNA扩充检测微生物药理学。3.药理学检测微生物药理学（常称为第三方微生物药理学）应符合《药理学检测微生物药理学基本标准（全面实施）》《药理学检测微生物药理学管理规范（全面实施）》等明确要求。三、操作业务流程1.咽拭子采样方法。被收集人员头部微仰，采样者将拭子越过降肌，在被收集者两侧咽鳙的稍微用力来回擦拭至少3次，将拭子头浸入含1～3ml病原体留存液（也可使用等渗氢氧化铝、组织培养基或磷酸盐碘化钾）的混合气体，尾部弃去，托盘管盖。2.样品混和。将收集的数个样品（原则上不超过5个）各取200ul进行充分混和，形成混和待检样品。该控制技术提示重点项目强调了适用于前提和微生物药理学前提，混样数量不超过5个。

二、10合1混样

2020年8月17日中华人民共和国国务院应付新式冠状病原体肺结核禽流感共管共管监督机制医疗保健抢救组正式发布了《新冠病原体多肽10合1混采检测控制技术标准》一、样品收集医用控制技术标准（一）病原体收集格普雷帽和瓶式应为聚丙烯织物，螺旋口可密封，较松适度。瓶式透明，可视度好。体外圆柱体（14.8±0.2）mm×（100.5±0.4）mm, 管帽圆柱体（15.8±0.15）mm,高度（12.5±0.5）mm。容量企业专题组10 ml，内含6ml胍盐或其他有效病原体cccDNA剂的留存液。留存液应带有更易观察、辨识的颜色（如粉红色），并保持一定的流动性，方便采样。（二）收集拭子宜选用聚酯、尼龙等非纯棉、非藻酸钙织物的拭子，且柄部是非木质材料。弄断点位于距拭子头顶端3cm左右，更易弄断。10合1混采检测控制技术标准从样品收集医用控制技术标准、收集地点明确要求、收集业务流程、化石经检测、微生物药理学接收、化石检测与质量控制、检测结果处置、检测后样品处置、控制技术人员基本明确要求、微生物安全可靠防护等十个方面详细规定了相关的控制用例。

三、20合1混样

2022年1月15日中华人民共和国国务院应付新式冠状病原体肺结核禽流感共管共管监督机制医疗保健抢救组正式发布了《新冠病原体多肽20合1混采检测控制技术标准》

一、样品收集医用控制技术标准（一）病原体收集格普雷帽和瓶式应为聚丙烯织物，螺旋口可密封，较松适度。瓶式透明，可视度好。收集管高度( 12.5±0.5 ) cm，容量企业专题组20-30mL，内含11-12mL 胍盐或其他有效病原体cccDNA剂的留存液。留存液应带有更易观察、辨识的颜色（如粉红色)，并保持一定的流动性，方便采样。（二）收集拭子宜选用聚酯、尼龙等非纯棉、非藻酸钙织物的拭子，且柄部是非木质材料。弄断点位于距拭子头顶端3cm左右，更易弄断。二、收集地点明确要求选择空旷、通风良好的场地作为大规模群体筛检集中收集地点。根据原有场地前提，划分为等候区、收集区、缓冲区和临时隔离区，有效分散待检人员密度。应设置急救设备备用。(一）等候区设置人行通道，同时设置一米线保证等候人员的防护安全可靠。根据天气前提配备保温、降温，遮阳、遮雨等设施。老年人、儿童、孕妇和其他行动不便者优先收集。（二）收集区根据气候前提，配备帐篷、冷/暖风扇、适量桌椅，保证医务人员在相对舒适环境下工作。配备收集用消毒用品、拭子、病原体收集管，并应为受检人员准备纸巾、呕吐袋和口罩备用。化石如无法及时运送至微生物药理学，需准备4℃冰箱或低温留存箱暂存。应制定防止病原微微生物扩散和感染的应急预案。（三）缓冲区空间应相对密闭，可供收集人员更换个人防护装备，放置与采样点规模相匹配的防护用品、收集用消毒用品、拭子和收集管，户外消杀设备。（四）临时隔离区用于暂时隔离在收集过程中发现的疑似患者或高危群体。三、收集业务流程(一）标识及信息登记1.登记业务流程：工作人员在收集前分配20个受检者为一组，收集前收集并登记受检者相关信息（包括姓名、性别、身份证号、联系电话、收集地点、收集日期和时间)，按照组别进行收集管编号。因20人相对较多，为避免不同组人员弄混，采样时，可采用2米线将下一组等候人员与正在收集的一组人员严格分隔开来，该组人员采完后，下一组人员才能有序进入采样区。2.登记明确要求：推荐使用身份证读卡器、二维码条码等信息化手段关联受检者信息，提高信息读取效率和准确性。（二）收集方法被收集人员头部微仰，嘴张大，发啊音，露出两侧咽鳙的，收集人员将拭子越过被收集人员降肌，在两侧咽鳙的稍微用力来回擦拭至少3次，然后在咽后壁上下擦拭至少3次。操作完毕后，将拭子头置入混合气体、拭子弄断点置于管口处，稍用力弄断使拭子头落入收集管的液体中，弃去弄断后的拭子杆，托盘管盖，将收集管置于稳定的置物架上。每例收集后收集人员均应进行手消毒。（三）混和拭子依照上述收集方法依次收集其余19支拭子，将完成收集的拭子放入同一收集混合气体，动作轻柔，避免气溶胶产生。连续收集20支拭子以后，托盘管盖，防止溢洒。注意咽拭子需浸入留存液内。如收集管内拭子不足20支，应做好特殊标记并记录。四、化石经检测（一）核对信息核对收集管标签与混采登记表信息，确保准确完整，编号一致。（二）化石放置明确要求将核对后的收集管放入透明塑料密封袋（一层容器）中并封严袋口，用75%乙醇喷洒密封袋外部。将密封袋放入二层容器（可选内配适量吸湿材料的包装盒或双层医用垃圾袋)，密封后用75%乙醇喷洒消毒。将二层容器放入具有微生物危害标识的专用化石转运箱（推荐使用符合《危险品航空安全可靠运输控制技术细则》A类物品运输UN2814标准的转运箱)，二层容器和转运箱之间应放置降温凝胶冰袋。二层容器应固定在转运箱中，保持化石直立。密封转运箱后，使用75%乙醇喷洒消毒，转运箱表面洁净无污染。（三）化石转运明确要求

标准转运箱应由专门化石运送人员负责运送。化石应在收集后2-4小时内送至微生物药理学。不能立即经检测的，应配备专门的冰箱或冷藏箱留存，并做好化石接收、留存登记。化石收集后24小时内可置于4℃留存。五、微生物药理学接收（一）化石签收运送和接收人员应付化石进行双签收。接收人员检查转运箱、二层容器有无破损。（二）化石打开应在微生物安全可靠二级微生物药理学核心区打开转运箱，取出二层容器。在微生物安全可靠柜中打开二层容器，用75%乙醇喷洒或擦拭消毒后，取出密封袋，用75%乙醇试剂喷洒或擦拭消毒，并检查是否密封完好。（三）化石检查取出收集管，检查管壁是否有破损、管口渗漏等，确认无破损、渗漏后用75%乙醇喷洒或擦拭消毒。如有破损、渗漏，应立即停止操作，用吸水纸覆盖后使用0.55%含氯消毒剂进行消毒处置，做好不合格登记后销毁。（四）化石留存不能及时检测的化石放入专用冰箱留存。24小时内检测的化石可置于4℃留存。24 小时内无法检测的化石应置于-70℃或下列温度留存。如无-70℃留存前提，则于-20℃暂存。避免化石反复冻融。设立专库或专柜留存化石，双人双锁管理。（五）转运容器移出使用后的二层容器内外壁经75%乙醇擦拭消毒后移出微生物安全可靠柜，实验结束后使用紫外灯照射消毒。七、检测结果处置新冠病原体多肽定性检测报告应包括检测结果(检出/阳性、未检出/阴性)、方法学、检出限等。（一）结果判断依据所用扩充试剂说明书，判断检测结果为未检出/阴性或者检出/阳性。（二）阳性结果复核1、混采检测结果为阳性、灰区或单个靶标阳性，通知相关部门对该混采管的20个受试者暂时单独隔离，并重新收集单管拭子进行复核。2、复核单管多肽检测如均为阴性，则按照阴性结果回报。暂时隔离人员即解除隔离；如检测结果阳性，按程序上报。

四、混样检测的极限在哪里？

混样检测的前提是预期误诊率。当误诊率在1%时，最佳混样数量是11混1，当误诊率是5%时最佳混样数量是5混1。混样效能计算公式：首先混样的结果中只有阴性或阳性，每次试验都是相互独立的随机事件。误诊率为，混样数量为，则有：1.检测为阴性的组，每个样品平均的检测次数为，概率为；2.检测为阳性的组，每个样品平均的检测次数为，概率为；预期每个样品的检测次数E（x）为：总的预期检测数量，也称为混样检测效率F： F=1/E（x）预期每个样品的检测次数E（x）越低，代表着混样检测越划算，1-E（X）则表示检测量减少的比例。