[扩增试剂生产厂家]Q6UHigh

wlza

作者

采用表明：

1.PCR化学反应管理体系的增设：

a.熔化并搅匀PCR化学反应所需的各式各样水溶液。将Q6U? High-Fidelity DNA Polymerase放于冰浴上或冰袋中。

b.参照附注在冰浴上增设PCR化学反应(假如有数个类似于的PCR化学反应，能依照化学反应数目先泡制脯氨酸和聚合酶以外的氧化物，接着装箱到各PCR化学反应波洛吉区。依照情形，有时候氧化物中能主要包括脯氨酸或聚合酶)：

Reagent

Final concentration

Volume

Final concentration

Volume

Nuclease-free water

(38.5-x)μl

(32.5-y)μl

10X Q6U? Buffer

5μl

dNTP (2.5mM each)

0.25mM each

5μl

0.5mM each

10μl

Template DNA

10pg-1μg*

xμl

10pg-1μg*

yμl

Primer mix (10μM each)

0.2μM each

1μl

0.4μM each

2μl

Q6U? High-Fidelity DNA

1U/50μl

0.5μl

1U/50μl

0.5μl

Total volume

50μl

*不同类型的DNA模板的推荐用量有所不同。哺乳动物基因组DNA：100ng；大肠杆菌基因组DNA：100ng；质粒DNA：5-30ng。扩充大于6kb的片段时，模板量宜适当加大，但过多的模板DNA也容易导致非特异性的PCR扩充产物。在推荐用量时相对会非常容易扩充出目的片段，实际应用时假如模板DNA的量比较少，完全能大大少于推荐的用量的。

注：参照上表，在扩充大于6kb的片段时dNTP和聚合酶的用量和扩充小于6kb片段时相比需要加倍。

c.用移液器轻轻吹打搅匀或轻微Vortex搅匀，室温离心数秒，使液体积聚集于管底。

d.假如所采用的PCR仪有热盖则省略本步骤。假如PCR仪没有热盖，则在波洛吉区滴入一滴矿物油(ST275)。

e.增设好的PCR化学反应管放于PCR仪上，开始PCR化学反应。

2.PCR化学反应参数的增设能参照如附注格：

STEP1

94℃ 3min

Initial denaturation

STEP2

94℃ 30sec

Denaturation

STEP3

55℃ 30sec

Annealing

STEP4

68℃ 15s/kb

68℃ 1min/kb

Extension

STEP5

Go To STEP2 for 30

PCR cycles

STEP6

68℃ 10min

68℃15min

Final extension

STEP7

4℃ forever

Hold

a.起始变性和变性的温度增设为94℃，延伸温度增设为72℃，其余条件不变时，都能进行正常的PCR扩充，但扩充效果会稍有下降。对于较难扩充的序列，推荐采用92℃变性和72℃延长。

b.PCR化学反应的增设需依照模板、聚合酶、PCR产物的长度和GC含量等条件的不同设定不同的温度、时间和循环数等。

c.STEP4 (Extension)的时间增设需依照PCR产物的长度进行增设，对于本产品扩充小于6kb的DNA片段时，推荐每kb产物的延伸时间为15秒。例如PCR产物的长度为1kb，则延伸时间能增设为15秒，PCR产物的长度为2kb，则延伸时间能增设为30秒，以此类推。扩充大于6kb的DNA片段时，推荐每kb产物的延伸时间为1分钟。例如PCR产物的长度为10kb，则延伸时间能增设为10分钟，PCR产物的长度为12kb，则延伸时间能增设为12分钟，以此类推。

d.对于初次进行的PCR，为尽量确保能扩充出预期的PCR产物，能把循环数增设为35。对于需进行半定量或定量的PCR化学反应，循环数一定要进行适当优化，使PCR化学反应没有达到平台期。

常见问题：

1.PCR产物非常少或没有特异性条带。

a.聚合酶设计不佳是PCR过程中最常见的问题。请选择适当的聚合酶设计软件进行聚合酶设计，注意聚合酶的GC含量、二级结构、二聚体、退火温度、长度、特异性等方面的问题。在加入酶切位点等的聚合酶中，一定要注意加入酶切位点等后整条聚合酶的GC含量、二级结构、二聚体、退火温度、长度、特异性等方面的问题。在原有聚合酶效果不佳的情形并且阳性对照聚合酶能正常工作的情形下，能考虑更换聚合酶。

b.待扩充片段GC含量偏高。GC含量较高的情形下PCR会变得相对比较困难，此时能采用适合扩充高GC含量DNA片段的GC-rich buffer，并相应地依照GC-rich buffer的要求或表明调整PCR化学反应参数的增设。直接添加1-10% DMSO或5-20%甘油对于扩充高GC含量的片段也有帮助。

c.PCR化学反应增设时在室温进行容易导致非特异性条件。推荐在冰浴上增设PCR化学反应。

d.由于聚合酶存在一定的二级结构或存在一定的聚合酶二聚体，或聚合酶偏短，导致退火效果不佳。此时能采用Touch down等方法进行退火，通常采用从65℃逐步缓慢降温到55℃或50℃的方法，使退火更加充分。

e.退火温度不佳，需要优化。假如有温度梯度PCR仪，则能增设退火的温度梯度，摸索退火的最佳温度。假如没有温度梯度PCR仪，则能通过多次PCR化学反应摸索最佳的退火温度。

f.延伸时间不足。能在推荐的延伸时间基础上把延伸时间延长2-5倍，对于较难扩充的片段能增设为每1kb延伸5分钟。

g.待扩充片段GC含量较高或长度较长，变性不够充分。能调节起始变性条件至95℃ 1min甚至95℃ 2-4min。

h.在不同PCR仪上进行PCR化学反应，避免有时候PCR仪出现问题。

i.循环数不足，适当延长PCR的循环数。通常循环数最高不必超过40，常用的循环数范围为25-35。

j.模板含量太低，适当加大模板量，或采用巢式PCR (nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即为在原先设计的PCR聚合酶内侧再设计一对PCR聚合酶，接着对第一次PCR产物进行稀释后再进行一次PCR扩充，这样一方面能起到扩充作用，同时也能从第一次PCR产物中扩充出特异性条带。二次PCR则为比较简单地用原有聚合酶对第一次PCR产物进行稀释后再进行一次PCR扩充，能起到扩充作用，但不能去除非特异性条带。

k.模板中含有抑制PCR化学反应的物质，能用适当的DNA纯化方法例如柱纯化等纯化模板DNA。

l.对PCR聚合酶进行脱盐纯化。

m.采用高质量的dNTP氧化物。

n.适当增加DNA polymerase的用量。

o.当产生较多非特异性条带时，能适当提高退火温度。

p.注意增设适当的阳性对照和阴性对照通常会有很大帮助。

2.杂带较多或条带弥散。

a.退火温度提高2-5℃。

b.减少DNA模板的用量。

c.PCR化学反应增设时在室温进行容易产生非特异性条带。推荐在冰浴上增设PCR化学反应。

d.适当减少Q6U? High-Fidelity DNA Polymerase用量。

e.适当缩短延伸时间。